1539 überlässt der spanische Kaiser einem Kreuzritter-Orden die Insel Malta. Als Zeichen, dass die Insel nach wie vor zur spanischen Krone gehöre, sollten die Ritter jährlich einen Falken als Tribut zollen. Aus Dankbarkeit ließ der Orden im ersten Jahr einen goldenen Falken fertigen. Dieser erreichte nie sein Ziel. Der Falke ist der Grund, weswegen 400 Jahre später in San Francisco gemordet und verraten wird. Erst wird Lewis Archer, Samuel Spades` (Humphrey Bogart) Partner aus der gemeinsamen Detektei, erschossen aufgefunden, kurz darauf Fred Thursby, der Mann, den Archer beschatten sollte. Alle und noch mehr Verdachtsmomente der Polizei führen zu Sam Spade.

Der spielt sein eigenes Spiel. Er gibt weder Miss Wonderly, später Brigid O’Shaughneassy (Mary Astor) als Auftraggeberin preis, noch deren Verbindung zum ermordeten Fred Thursby. Andererseits bedenkt er immer auch den möglichen Profit, der für ihn dabei herausspringen könnte. Er enthält auch sein Wissen um Kaspar Gutman (Sydney Greenstreet) vor, der die Spur des Malteser Falken seit 17 Jahren verfolgt. Spade findet heraus, dass Brigid, der ermordete Thursby und Joel Cairo (Peter Lorre) für Gutman gearbeitet und ihn bei der Beschaffung der Statuette übers Ohr gehauen haben. Der Plan schlug fehl, woraufhin die Drei in Streit gerieten. Inzwischen bietet Gutman ihm 50 000 Dollar für die Beschaffung des Falken, Spade hat sich in Brigid verliebt, die Polizei ist hinter ihm her und die Morde sind noch immer nicht aufgeklärt. Im Spiel Jeder gegen Jeden gelingt es Spade des Falken habhaft zu werden. Doch der erweist sich als Fälschung …
„Die Spur des Falken“ (Hustons Regie-Debut) wird oft als Auftakt zur ‚schwarzen Serie’ oder dem film noir gehandelt. Das namensgebende Spiel von Licht und Schatten (nach dem Vorbild von Murnau oder Lang) trifft in Hollywood auf die hard-boiled-writers des Pulp-Magazins „The Black Mask“, in dem Dashiell Hammett seinen dritten Roman „The Maltese Falcon“ (1930) veröffentlicht hat.